D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
U fungus fitopatogenu Colletotrichum coccodes provoca malatie periculose di patate è tomate, cunnisciute cum'è antracnose è tuber black spot. Basatu nantu à e caratteristiche morfologiche, sò spessu difficiuli di distingue da e malatie causate da altri microorganismi; Nantu à i frutti di tomate verde, a malatia pò esse asintomatica, apparsu solu nantu à frutti rossi maturi. Per un diagnosticu rapidu è precisu di u patogenu, un sistema di test PCR in tempu reale hè offertu. Per sviluppà un sistema di teste, a sequenza di nucleotidi di u genu di glycerol triphosphate dehydrogenase hè stata determinata per 45 ceppi di C. coccodes isolati da tuberi di patata in diverse regioni di Russia.
Basatu nantu à i risultati ottenuti è l'analisi di sequenze simili di altre spezie dispunibuli in a basa di dati GenBank, i primi spezii specifichi è una sonda sò stati disignati per C. coccodes. Per verificà a specificità di u sistema di teste creatu, a PCR hè stata realizata cù DNA isolatu da culturi puri di 15 spezie diverse di fungi parassiti è saprotrofi assuciati à e piante di tomate è patata (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani). , Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). A prisenza di l'ADN di Colletotrichum coccodes hè stata rilevata à un ciclu di soglia di 20-27, mentre chì l'altri spezii sò stati rilevati dopu à 40 cicli o ùn sò micca stati rilevati. U sistema di teste permette di detect in modu affidabile C. coccodes cuncentrazione di DNA chì supera 0.01 ng/mm3 in a mistura PCR analizata. Utilizendu u sistema di teste sviluppatu, a prisenza di C. coccodes hè stata studiata in foglie di tomate cù sintomi di malatie fungi è in tuberi di patata senza sintomi esterni di a malatia. Foglie cù sintomi d'infezzione fungica sò stati cullati da dui campi diffirenti in a regione di Krasnodar, tuberi - da i campi in a regione Kostroma, Mosca, Kaluga è Nizhny Novgorod. In a regione di Krasnodar, una foglia di tomate chì cuntene DNA di C. coccodes hè stata trovata; a presenza affidativa di DNA di stu patogenu hè stata detta in 5 campioni di tuberi cultivati in e regioni di Kostroma, Mosca è Kaluga.
Introduzione
I fungi di u genus Colletotrichum sò fitopatogeni periculosi chì attaccanu grani, ligumi, erbe è frutti perenne è frutti di bacca. Una di e spezie omnipresente di stu genus, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, hè l'agentu causativu di l'antracnosi è u puntu nìvuru di patate è pumati, è provoca malatie di parechje altre piante di a famiglia di nightshade, incl. erbacce (Dillard, 1992). C. coccodes infects all underground parts of the plant, stem basis, leaves and fruits (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Nantu à a pelle di i tuberi di patata infettati, si osserva u sviluppu di spots grigi cù bordi vagamente definiti, nantu à quali spots neri di sporulazione è microsclerotia sò chjaramente visibili. Duranti l'almacenamiento, l'ulceri cù u cuntenutu struitu pò esse formate in a polpa di tuberi, i.e. a malatia entra in a fase antracnose, chì, però, hè assai rara.
À u listessu tempu, i sintomi di l'antracnosi (ulceri cuparti di pelle cù picculi punti neri) sò tipici nantu à i frutti di tomate. Nant'à e foglie, i sintomi di e lesioni di C. coccodes appariscenu cum'è spots marroni scuri, generalmente cunfinati da u tissutu giallu (Johnson, 1994).
U sviluppu di spotting neru nantu à i tuberi spoils u so aspettu, chì hè soprattuttu pronunzianu quandu vende patate lavate di pelle rossa. A separazione di buccia porta à l'evaporazione eccessiva è à l'aumentu di perdite di almacenamiento (Hunger è McIntyre, 1979). U dannu à l'altri organi di a pianta porta à perdite di rendiment, chì hè stata nutata in cundizioni di terra aperta è chjusa (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Malatii causati da C. coccodes sò cumuni in quasi tutte e regioni di patate di u mondu, cumpresa a Russia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). U cuntrollu di sti malatie hè difficiule per l'efficacità insufficiente di fungicidi esistenti contru C. coccodes è a mancanza di variità resistenti (Read and Hide, 1995).
L'inoculum di C. coccodes pò esse cunsirvatu in tuberi di sementi (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), sementi di tomate (Ben-Daniel et al., 2010), è sopravvive per un bellu pezzu in u tarrenu è nantu à i detriti vegetali (Dillard, 1990; Dillard, Cobb, 1993) è in erbacce (Raid, Pennypacker, 1987). I travaglii di parechji autori (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) anu dimustratu chì u sviluppu di a malatia nantu à i patate è i pumati dipende largamente da a prisenza. di inoculum in u materiale di sumente è in terra. Per quessa, per minimizzà e pèrdite da a malatia, hè necessariu di diagnosticà (inclusi quantitativi) propaguli fungi in materiale di sementa, in terra, in tuberi di sementi di patata è sementi di tomate guardati per u almacenamentu. U diagnosticu morfologicu in a terra è u materiale vegetale pò esse realizatu solu da a presenza di microsclerotia, chì, però, si trovanu ancu in altri tipi di fungi.
I sintomi nantu à i tuberi sò assai simili à a scab d'argentu, causata da u fungus Helminthosporium solani. L'isolamentu di Colletotrichum coccodes è Helminthosporium solani in a cultura pura hè abbastanza difficiule è dura assai tempu per via di a crescita lenta nantu à un mediu nutriente. Per identificà rapidamente Colletotrichum coccodes, hè necessariu di utilizà metudi di diagnostichi strumentali. U metudu più còmuda hè a reazione di a catena di polimerasi (PCR) è a so mudificazione - PCR in tempu reale. Attualmente, in Europa è in i Stati Uniti, un sistema di teste sviluppatu da circadori inglesi (Cullen et al., 2002) per a regione ITS1 di rDNA hè utilizatu. U so usu hà ancu dimustratu boni risultati in l'analisi di isolati russi (Belov et al, 2018). In ogni casu, C. coccodes hè assai variabile è a so rilevazione cù una sola sequenza di DNA pò purtà à risultati falsi negativi. Per una affidabilità di diagnostica più grande, hè necessariu un analisi di parechje sequenze di DNA specifichi di spezie, è per quessa avemu sviluppatu un sistema di teste originale chì ci permette di identificà C. coccodes da a sequenza di u genu glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Materiali è metudi
Per valutà l'efficacezza è a specificità di i sistemi di teste creati, i culturi puri di 15 spezie di fungi isolati da l'autori da i campioni affettati di foglie di tomate è frutti è tuberi di patata sò stati utilizati (Table 1). Per l'isolamentu, l'organi di a pianta cù sintomi di infezzione fungali sò stati pigliati, micca più di un organu per machja.
Una seccione di un tubercu cù buccia, una fetta di fruttu di tomate, o una foglia affettata sò stati posti sottu un microscopiu binoculare, dopu chì u miceliu, spori o un pezzu di tissutu sò stati trasferiti à un mediu agar (wort agar) in una piastra Petri. cù una agulla dissecting sharpened sharpened. L'isolati sò stati conservati nantu à agar slants in provette à 4 ° C.
I campioni di foglie di tomate destinati à l'analisi cù sintomi di malatie fungi immediatamente dopu a cullizzioni (in u campu) sò stati posti in 70% alcolu etilicu in quale sò stati guardati finu à l'estrazione di DNA. I tuberi di patata sò stati mandati à u laboratoriu, sbucciati (2 × 1 cm piece) è congelati à -20 ° C. Sò stati conservati congelati finu à l'estrazione di DNA.
I culturi puri di fungi per l'estrazione di l'ADN sò stati cultivati in medium pea liquid. U miceliu fungicu hè statu eliminatu da u mediu liquidu, seccu nantu à carta di filtru, congelatu in nitrogenu liquidu, homogeneizatu, incubatu in buffer CTAB, purificatu cù cloroformu, precipitatu cù una mistura di isopropanol è acetate di potassiu 0.5 M, è lavatu duie volte cù 2% alcolu. . L'ADN resultante hè statu dissolutu in acqua deionizzata è almacenatu à -70 ° C (Kutuzova et al., 20). A cuncentrazione di DNA hè stata misurata cù u kit di quantificazione di DNA HS per DNA a doppia fila in Qubit 2017 (Qiagen, Germania). I campioni cunservati è congelati sò stati macinati in nitrogenu liquidu, dopu l'ADN hè statu isolatu cum'è descrittu sopra (per miceliu di culturi fungi puri).
Table 1. Origine di ceppi fungi utilizati in stu travagliu
Nome di u fungo | pianta, organu | Locu di selezzione |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tuberi di patata | Regione Kostroma, tuberi di patata di a 1a generazione di campu, varietà Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | foglia di patata | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | tuberi di patata | Regione di Magadan, pos. Tenda, tuberi di patata |
Cladosporium fulvum | foglia di tomate | A regione di Mosca, u pumadoru grande fruttu |
Alternaria tomatophila | fruttu di tomate | trasferitu da l'impiegati di u laboratoriu di micologia è fitopatologia di l'Istitutu di Ricerca All-Russian di Prutezzione di e piante |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | fruttu di tomate | Regione di Krasnodar, distrettu di Crimea, varietà Slivka |
Fusarium oxysporum | radica di granu | A Mosca |
A PCR hè stata realizata cù un amplificatore DTprime (DNA-Technology). Per eseguisce a PCR, avemu utilizatu primers originali è una sonda per una regione specifica di a spezia di u gene di glicerol trifosfato deidrogenasi: primer forward Coc70gdf -TCATGATATCATTTCTCTCACGCA, primer reverse Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGA, sonda Cocgdz - (BGTFAMTTGA)--(BGTFGTTGA) GGGCTGCTGCCG(p). I primers amplificanu una regione di 1 bp.
A reazione implicava 50 ng di DNA tutale (quandu si analizzanu foglie è tuberi) è 10 ng (quandu si analizzanu DNA da culturi fungi puri). A mistura di reazione (35 μl) hè stata divisa in dui parti da una strata di paraffina: quella inferiore (20 μl) cuntene 2 μl di tampone di reazione 10x (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4)2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween-20), 0.5 mM ogni trifosfato deossinucleotide, 7 pmol ogni primer e 4 pmol sonda fluorescente idrolizzabile; u top one cuntene 1 μl di 10× PCR buffer è 1 unità di Taq polymerase.
A separazione di a mistura cù a paraffina permette à i tubi per esse guardatu per un bellu pezzu à una temperatura di 5 ° C è per assicurà un iniziu caldu di a PCR dopu chì sò stati riscaldati per 10 minuti à una temperatura sopra 80 ° C. A PCR hè stata realizata secondu u prugramma: 94.0 ° C - 90 s (1 ciclu); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 cicli); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 cicli); 10.0 ° C - almacenamiento.
Risultati è discussione
E sequenze di u genu di glycerol triphosphate dehydrogenase sò state determinate in 45 ceppi isolati da foglie, steli, tuberi di patata è frutti di tomate (Kutuzova, 2018) in diverse regioni di Russia. E sequenze studiate di tutti i ceppi sò stati divisi in 2 gruppi, chì si differenzianu in dui nucleotidi. E sequenze di nucleotidi di rapprisentanti di i dui gruppi sò stati dipositati in GenBank sottu i numeri KY496634 è KY496635.
I primers coc70gdf, coc280gdr è a sonda cocgdz custruita nantu à a so basa sò stati verificati cù u prugramma BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) nantu à tutte e sequenze di geni di glycerol triphosphate dehydrogenase dispunibuli in a basa di dati GenBank da spezie di u genus Colletotrichum è altri organismi.
Aucune région d'ADN d'autres organismes hautement homologues aux amorces et à la sonde n'a été trouvée.
A sensibilità di u sistema di teste hè stata pruvata usendu campioni cù diverse concentrazioni di C. coccodes DNA, DNA da una foglia di patata affettata da antracnose (raccolta in 2017 in Mari El, varietà Red Scarlett), è buccia di tuberi affettati da spot neru (collect in a regione Kostroma, varietà Red Scarlett, Table 2). Per cunfirmà a prisenza di DNA in i tuberi di patata è e foglie, i ceppi di C. coccodes sò stati isolati da elli in i culturi puri.
I risultati di l'analisi di sensibilità di u sistema di teste dimustranu chì pò esse usatu per diagnosticà cù successu a presenza di C. coccodes DNA in una mostra se u so cuntenutu tutale in a mistura PCR hè più di 0.05 ng. Questu hè abbastanza per a deteczione, postu chì una sclerotia cuntene in media 0.131 ng, è una spore - circa 0.04 ng di DNA (Cullen et al., 2002). U sistema di teste sviluppatu da u gruppu inglese (Cullen et al., 2002) hà dimustratu una sensibilità simili (ciclu di soglia 34 à 0.05 ng di DNA è 37 à 0.005 ng).
Analysis di campioni naturali chì cuntenenu C. coccodes in tutti i casi hà permessu di detect reliably a so prisenza in a mostra (Table 2). U metudu prupostu per l'estrazione di DNA hè ancu appiicatu à l'analisi di e piante naturali.
Tabella 2. Determinazione di a sensibilità di u sistema di prova d'identificazione di Colletotrichum coccodes propostu per PCR in tempu reale
Образец | Quantità di DNA in campione*, ng | Ciclu di u sogliu | Deteczione di C. coccodes |
---|---|---|---|
Micelio di Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
buccia di tuberi 1 | 50 | 32 | + |
buccia di tuberi 2 | 50 | 30 | + |
buccia di tuberi 3 | 50 | 31.5 | + |
foglia di patata | 50 | 29.5 | + |
Nota. * In una mistura di prudutti PCR.
A specificità di u sistema di teste hè stata pruvata nantu à campioni di DNA estratti da 15 spezie di fungi. Tutti i ceppi fungi sò stati isolati da l'autori da frutti è foglie di tomate affettati è sani, è tuberi di patata; una ceppa hè stata isolata da a radica di granu (Table 1). Trà quelli isolati da a superficia di u fruttu ci sò ancu spezie chì ùn sò micca patogeni per u tomate (per esempiu, Phellinus ferrugineovelinus).
I studii anu dimustratu chì l'ADN di C. coccodes hè statu scupertu à un ciculu di soglia di 20-27, mentri àutri spezie fungi ùn anu micca scupertu o datu un signalu dopu à u ciculu 40, chì pò esse attribuitu à un effettu di u rumore non specificu (Table 3).
Table 3. Test di sistema di prova nantu à parechji tipi di funghi
Nome di u fungo | Ciclu di u sogliu |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. coccodes 2 | 22.6 |
C. coccodes 3 | 23 |
C. coccodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatephila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicilliu NS. | > 40 |
Nota. * A quantità di DNA in tutti i campioni era 10 ng.
U sistema di teste sviluppatu hè stata utilizata per identificà C. coccodes in campioni di foglie di tomate cù sintomi di danni da i patogeni necrotrofichi è tuberi di patata di sementi senza sintomi visibili. Per u studiu, i tuberi di sementi di variità cultivate in e regioni di Kostroma, Mosca, Kaluga è Nizhny Novgorod sò stati pigliati. A prisenza di C. coccodes DNA hè stata cunsiderata affidabile in i campioni in quale u ciculu di u limitu ùn hà micca più di 35. Stu valore di u limitu hè statu sceltu basatu nantu à a deteczione affidativa di 0.05 ng di C. coccodes DNA (ciclu di limitu 33.5, Table 2) è u fattu chì quandu At threshold cycles sopra 40, DNA nonspecificu di qualchi altri spezie fungi hè statu diagnosticatu. Cù questu approcciu, a presenza affidativa di C. coccodes DNA hè stata rilevata in 5 campioni di tuberi cultivati in e regioni di Kostroma, Mosca, Kaluga è in una foglia di tomate da u distrittu Yeisk di u Territoriu Krasnodar (Table 4, 5).
Tabella 4. Rilevazione di Colletotrichum coccodes nantu à i tuberi di patata *
numeru di mostra | Variità di patata | Lu locu di crescita | Deteczione di C. coccodes | Ciclu di u sogliu |
---|---|---|---|---|
1 | Red Scarlet | regione di Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | A Mosca | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky prima | A Mosca | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | riggiuni Kaluga. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasia | riggiuni Kaluga. | - | |
15 | Gala | Regione di Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Nota. * A quantità di DNA in tutti i campioni era 50 ng.
Tabella 5. Rilevazione di Colletotrichum coccodes nantu à foglie di tomate*
numeru di mostra | Lu locu di crescita | Deteczione di C. coccodes | Ciclu di u sogliu |
---|---|---|---|
1 | Regione di Krasnodar, distrettu di Crimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Regione di Krasnodar, distrittu di Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* A quantità di DNA in tutti i campioni era 50 ng.
U sistema di teste chì avemu creatu ùn hè micca inferjuri à quellu sviluppatu da i circadori inglesi (Cullen et al., 2002) in sensibilità è specificità è hè adattatu per l'analisi di e piante di e piante. U so usu per l'analisi di i tuberi di sementi hà permessu di detectà C. coccodes DNA in tuberi senza signali esterni di danni è per analizà bè l'infezzione di e foglie.
In Russia, finu à a data, i tuberi di patata ùn sò micca stati analizati per l'infezzione C. coccodes. U nostru primu studiu dimustrava chì fora di 16 tuberi di sementi pruvati cultivati in diverse regioni di a Federazione Russa, 5 cuntenenu C. coccodes. Questu mostra chì u puntu nìvuru di i tuberi di patata hè una malatia di patata cumuni in Russia, è u so rolu in a riduzzione di u voluminu è a qualità di a cultura di patata hè sottovalutata.
Quandu analizà e foglie di tomate, una presenza affidativa di C. coccodes DNA hè stata rilevata in una foglia da u distrittu Yeisk di u Territoriu Krasnodar. Nanzu, quandu esaminà i campi di tomate in u sudu di Russia utilizendu un sistema di teste britannicu (Cullen et al., 2002), foglie chì cuntenenu C. coccodes sò stati identificati, è in certi campi una alta proporzione di foglie affettati da C. coccodes hè stata trovata (Belov et al., 2018). al., XNUMX). In i territorii di Krasnodar è Primorsky è a regione di Mosca, avemu scupertu frutti di tomate, da quale avemu pussutu isolà i culturi puri di C. coccodes. Hè pussibule chì C. coccodes hè assai più diffusa nantu à i pumati in Russia di ciò chì si crede oghje, è a so dannità hè ancu sottumessa.
Cusì, finu à a data, l'infurmazioni suffirenzi sò accumulate nantu à a distribuzione generalizata di C. coccodes nantu à patate è pumati.
Per capisce megliu u rolu di stu fungus in u sviluppu di e malatie di patate è tomate, hè necessariu un seguimentu estensivu di a so prevalenza in Russia, u studiu di u rolu di l'infizzioni di a terra è di a sumente, è u rolu di u puntu nìvuru in i perditi di almacenamento. L'usu di diagnostichi PCR pò facilità significativamente stu travagliu, è l'utilizazione simultanea di i dui sistemi di teste aumenterà significativamente a precisione di l'analisi.
U travagliu hè statu sustinutu da a Fondazione di a Scienza Russa cuncessione N ° 18-76-00009.
L'articulu hè statu publicatu in a rivista "Mycology and Phytopathology" (Vol. 54, No. 1, 2020).