EAT. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Hè statu recentemente dimustratu chì u fungu ascomicete Ilyonectria crassa hè capace di infettà i tuberi di patata. Stu travagliu hè u primu à analizà e caratteristiche biologiche è a resistenza à certi fungicidi di a ceppa I. crassa isolata da e patate. E sequenze di regioni specifiche à e spezie di u ceppu "patata" coincidenu cù quelle ottenute prima per i funghi isolati da e radiche di narciso, ginseng, aspen è faggio, bulbi di gigli è foglie di tulipanu. Apparentemente, parechje piante selvatiche è di giardinu ponu esse riserve di I. crassa. A ceppa investigata hà infettatu u pumadoru è e fette di patata, ma ùn hà micca infettatu u fruttu tutale di u pumadoru è u tuberu di patata intattu. Ciò mostra chì I. crassa hè un parassita di ferita. Valutazione di a resistenza à fludioxonil, difenoconazole è azoxystrobin nantu à un mezu nutrizionale hà mostratu alta efficacia di questi farmaci.
L'indicatore EC50 (a cuncentrazione di u fungicida, chì rallenta di 2 volte u ritmu di crescita radiale di a culunia paragunatu à u cuntrollu micca fungicida) era uguali à 0.4; 7.4 è 4 mg / l, rispettivamente. A pussibilità di u sviluppu di a malatia causata da I. crassa deve esse presa in contu quandu a valutazione fitopatologica di i tuberi di patata è u sviluppu di misure di prutezzione di e piante.
U sviluppu di microorganismi fitopatogeni porta à elevate perdite in tutte e fasi di crescita è di conservazione di patate. Quandu si pianificanu misure protettive, di regula, sò presi in contu patogeni ben cunnisciuti, cume e spezie di i generi Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, ecc. A so biologia hè pocu studiata, l'efficacità di i fungicidi aduprati nantu à e patate in relazione à elle hè scunnisciuta, i metudi di diagnosticu ùn sò micca stati sviluppati. Cù un sviluppu massivu, sò capaci di causà danni significativi à a cultura di a patata. Unu di sti microorganismi hè u fungu ascomicete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, primu scupertu da l'autori nantu à i tuberi di patata (Chudinova et al., 2019).
Stu travagliu presenta i risultati di l'analisi di a ceppa I. crassa isolata da i tuberi di patata. A morfologia di e culunie è e strutture miceliali di I. crassa, e sequenze nucleotidiche di regioni di DNA specifiche à e specie, a virulenza à e patate è i pumati è a resistenza à certi fungicidi pupulari sò stati studiati.
Materiali è metudi
Avemu usatu a ceppa I. crassa 18KSuPT2 isolata in u 2018 da u tuberu di patata infettatu cultivatu in a regione Kostroma. U tuberu hè statu influenzatu da un tippu di putrefazione secca cù una cavità coperta di miceliu marrone chjaru. Aduprendu una agulla sterile di dissezione, u miceliu fungu hè statu trasferitu in una piastra Petri cù un mezzu agar (mostu di birra 10%, agar 1.5%, penicillina 1000 U / ml). I piatti sò stati incubati à u bughju à 24 ° C.
Un microscopiu di luce Leica DM2500 cù una fotocamera digitale ICC50 HD è un microscopiu binoculare Leica M80 cù una fotocamera digitale IC80HD (Leica Microsystems, Germania) sò stati aduprati per fotografià, valutà a dimensione è a morfologia di e spore è di l'organi di spore.
Per isolà l'ADN, u miceliu fungu hè statu cultivatu in mezu à pisu liquidu, po ghjelatu in azotu liquidu, omogeneizatu, incubatu in tampone CTAB, purificatu cù cloroformu, è lavatu duie volte cù 2% alcolu.
U metudu di estrazione di DNA hè descrittu in dettaglio in l'articulu da Kutuzova et al. (2017).
Per determinà e spezie per metudi moleculari è paragunà cù altri ceppi di I. crassa cunnisciuti, a PCR hè stata effettuata cù primer chì permettenu l'amplificazione di e regioni specifiche di DNA: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), regioni geniche -tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) è fattore di allungamentu di traduzzione 1α (tef1α) (primers EF1-728F / EF1-986R, Carbone è Kohn, 1999). Ampliconi di a lunghezza desiderata sò stati estratti da u gel cù u kit Evrogen CleanUp. E regioni amplificate sò state sequenziate cù u BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) nantu à un Applied Biosystems 3730 xl sequencer automatizatu (Applied Biosystems, CA, USA). E sequenze nucleotidiche ottenute sò state aduprate per circà una partita in a basa di dati GenBank di u Centru Naziunale di l'Infurmazioni Biotecnologiche (NCBI) di i Stati Uniti. L'analisi filogenetica hè stata effettuata aduprendu u prugramma MEGA 6 (Tamura et al., 2013).
A determinazione di a virulenza hè stata effettuata nantu à frutti verdi sani di un pomodoro à grande fruttu (varietà Dubrava) è di tuberi di patate (varietà Gala). Inoltre, per simulare danni à frutti è tuberi danneggiati, avemu usatu fette di i stessi frutti è tuberi. Fette di tuberi sò stati posti in camere umide, chì eranu piatti Petri cun carta filtrante umida in fondu. Una diapositiva hè stata posta nantu à a carta, nantu à a quale, à u so tornu, sò stati posti fette di tuberi o frutti. Tuberi interi è frutti sò stati ancu posti in cuntenituri cù carta filtrante umida in fondu. In u centru di a fetta (o nantu à a superficia intatta di u tuberu o di u fruttu), un pezzu di agar (5 × 5 mm) cù ife fungiche hè statu postu dopu à 5 ghjorni di crescita nantu à l'agar di u mostu.
A valutazione di a resistenza di e ceppi fungali à i fungicidi hè stata effettuata in cundizioni di laburatoriu nantu à u mezu nutriente agar. Avemu studiatu a suscettibilità à droghe fungicidi Maxim, KS (ingrediente attivu fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Catalogu statale ..., 2020). A valutazione hè stata effettuata in piatti Petri nantu à u mediu di u mostu-agar cù l'aggiunta di i farmaci investigati à concentrazioni di a sostanza attiva 0.1; unu; 1 ppm (mg / L) (per fludioxonil è difenoconazole), 10; deci; 1 ppm (per azoxystrobin) è in media senza fungicida (cuntrollu). U fungicida hè statu aghjuntu à u fondu è raffreddatu à 10 ° C mezu, dopu à u mezu hè statu versatu in piatti Petri. Un bloccu agar cù miceliu fungicu hè statu piazzatu à u centru di una piastra Petri è cultivatu à una temperatura di 100 ° C in u bughju. Dopu à 60 ghjorni d'incubazione, i diametri di e culunie sò stati misurati in duie direzzioni reciprocamente perpendiculari; i risultati di misurazione per ogni culunia sò stati mediati. L'esperimenti sò stati fatti in triplicatu. Basatu nantu à i risultati di l'analisi, l'EC24 hè statu calculatu, uguale à a concentrazione di u fungicida, chì dimezzò u tassu di crescita radiale di a culunia paragunatu à u cuntrollu fungicida.
Risultati è discussione
Nantu à i piatti Petri cù l'agar di u mostu, u fungu hà furmatu culunie cù miceliu flocculente biancu. U medium sottu u miceliu diventò rossu-rossu. Quandu u mezzu si secca, u fungu hà furmatu spore di dui tippi nantu à conidiofori singuli è aggregati in picculi sporodochia. I Macroconidia sò allungati, cilindrici, cun unu à trè septi, lunghezza media 27.2 µm cun una gamma di valori da 23.2 à 32.2 µm, larghezza - finu à 4.9 µm (Fig. 1). A lunghezza media di microconidia hè 14.3 µm cun una gamma di valori da 10.3 a 18.1 µm, a larghezza hè finu à 4.0 µm. Tutti i caratteri macro è micromorfologichi si adattanu à a gamma di variazioni di a spezia Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
E sequenze di regioni di DNA specifiche à e spezie (ITS, b-tubulin, TEF 1α) coincidenu cumpletamente cù e sequenze di i ceppi I. crassa chì avemu studiatu nanzu (Chudinova et al., 2019, Tabella 1). Per studià a prevalenza di I. crassa in altre regioni è per analizà u spettru di e culture affettate, sò state analizate sequenze analoghe di DNA in a basa di dati GenBank (Tabella 1). A sovrapposizione era di 86 à 100%. E sequenze di e trè regioni di DNA di u ceppu "patata" I. crassa eranu identiche à e sequenze di e ceppe isolate da u bulbu di lilia è di e radiche di narciso in Olanda è da a radice di ginseng in Canada. Ùn simu micca riesciuti à truvà altre razze di I. crassa cù trè sequenze simili analizate in basi di dati aperte. Tuttavia, l'analisi di e sequenze ITS depositate è b-tubulina hà mostratu a presenza di I. crassa nantu à e foglie di tulipanu in u RU. I funghi cù una sequenza ITS simile sò stati identificati in l'analisi di a micobiota di radiche di aspen in Canada è radiche di faggio in Italia, tuberi di patata in Arabia Saudita (Tabella 1). I risultati di stu studiu mostranu chì I. crassa hà una distribuzione globale è hè capace di infettà varie spezie vegetali.
Quandu si determina a patogenicità nantu à fette di pomodoro è di patata u 5u ghjornu, u diametru di a lesione hà righjuntu 1.5 cm. U ceppu investigatu ùn hà micca infettatu u fruttu di u pumadoru sanu è u tuberu di patata intattu. Tuttavia, i sepali sò stati affettati nantu à u pumadoru. Per escludere a pussibilità di cuntaminazione da u miceliu sviluppatu nantu à a fetta di tuberu di patata, un isolatu fungicu hè statu isolatu in una cultura pura. Era cumpletamente identicu à a tensione parentale. Apparentemente, I. crassa hè un parassita di ferita.
U trattamentu di pre-piantazione di tuberi di sementi cù fungicidi riduce u sviluppu di malatie nantu à e piante durante a stagione di crescita. Per a selezzione di fungicidi efficaci, hè impurtante valutà chì di elli sò efficaci contr'à I. сrassa. U travagliu hà studiatu e sostanze attive diffuse di fungicidi - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil hè inclusu in parechji mischji aduprati per curà e sementi è i tuberi di sementi prima di piantà. Fludioxonil (Maxim) hè ancu usatu per trattà i tuberi di sementi prima di almacenà. Difenoconazole è azoxystrobin sò ancu inclusi in una serie di preparazioni aduprate per a trasfurmazione di materiale di sementi, è ancu in preparazioni destinate à trasfurmà e piante vegetative (Catalogu statale ..., 2020).
U ritmu di crescita di I. crassa hè statu studiatu nantu à i media (Fig. 2) cù diverse concentrazioni di ingredienti attivi: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), è difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabella 2). Queste preparazioni ponu esse cunsiderate assai efficaci contr'à I. crassa, postu chì u so EC50 hè significativamente inferiore à a concentrazione raccomandata di a preparazione in u fluidu di travagliu adupratu per trattà i tuberi. Sicondu u Catalogu Statale ... (2020), a concentrazione di fludioxonil in u liquidu per trattà i tuberi di patate hè da 500 à 1000 ppm, azoxystrobin (in u liquidu per trattà u fondu di u solcu) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (in u liquidu per trattà e piante vegetative) - 187.5- 625 ppm.
Tabella 1. Similitudine di sequenze di sequenze specifiche di specie di ceppa 18KSuPT2 è ceppi di Ilyonectria crassa dispunibili in a basa di dati Genbank
Strain | Pianta ospitante, situ di escrezione | Numeri di sequenza depositati in GenBank, percentuale di similarità | a lea | ||
ITS | β-tubulina | TEF 1α | |||
17KSPT1 è 18KSuPT2 | Tuberu di patata, regione Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, stu travagliu |
CBS 158/31 | Radici di Narcissu, Paesi Bassi | Jfxnumx 100 | Jfxnumx 100 | Jfxnumx 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Bulbo di giglio, Paesi Bassi | Jfxnumx 100 | Jfxnumx 99.7 | Jfxnumx 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Radice di Ginseng, Canada | AY295311 99.4 | Jfxnumx 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS 235138 | Foglia di tulipanu, UK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Radiche Aspen, Canada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Fagiu, Italia | KR 019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Sottumissione diretta |
KAUF19 | Tuberu di patata, Arabia Saudita | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = micca depositu
Tabella 2. Resistenza di Ilyonectria crassa à i fungicidi
(sustanza attiva) | EC50, ppm | ||||
Ghjornu di 3 | Ghjornu di 5 | Ghjornu di 7 | |||
Cuntrolli | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
In u nostru travagliu, i ceppi I. crassa sò stati isolati da i tuberi di patate in e regioni di Kostroma è Mosca (Chudinova et al., 2019). Una alta proporzione di ceppi fungali cù e so sequenze identiche à I. crassa hè stata rivelata quandu si analizava a micobiota di i tuberi di patata in Arabia Saudita (Gashgari è Gherbawy, 2013). Apparentemente, I. crassa ùn hè micca cusì rara nantu à e patate cum'è puderia sembrà. E nostre sperienze anu dimustratu chì u fungu puderia infettà frutti di pomodori danneggiati. Da a letteratura si sà chì I. crassa hè capace di sviluppà saprotroficamente in u terrenu (Moll et al., 2016), è ancu di influenzà una varietà di piante, ancu tassonomicamente luntane cum'è narcisi, gigli, ginseng, aspen, fagiu (Tabella unu). Apparentemente, parechje piante selvatiche è di giardinu ponu esse riserve di I. crassa. Quì sopra mostra chì quandu si sviluppanu misure di prutezzione, hè necessariu piglià in contu a pussibilità di influenzà i tuberi di patate cù stu fungu. E preparazioni diffuse per u trattamentu di i tuberi di patate chì cuntenenu fludioxonil, azossistrobina è difenoconazole anu mostratu una alta efficacia fungicida contr'à I. crassa.
Stu travagliu hè statu sustinutu da a Fundazione Russa per a Ricerca Basica (Grant No. 20-016-00139).
L'articulu hè statu publicatu in a rivista "Bulletin de Protection des Plantes", 2020, 103 (3)